冰凍切片免疫熒光單標實驗方法-上海鄭核

一、實驗器材及試劑

1、實驗器材

名稱 廠家 型號

冰凍切片機 Thermo Cryotome E

載玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司 80312-3181

載玻片 Servicebio

微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司 P70D20TL-P4

脫色搖床 Servicebio TSY-B

渦旋混合器 Servicebio MX-F

掌上離心機 Servicebio D1008E

移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573

組化筆 Gene tech GT1001

冰箱 青島海爾股份有限公司 BCD-192TGN

正置熒光顯微鏡 日本尼康 Nikon Eclipse C1

成像系統(tǒng) 日本尼康 Nikon DS-U3

2、主要實驗試劑

試劑 廠家 貨號 稀釋比

OCT包埋劑 Sakura 4583

EDTA（PH8.0)抗原修復(fù)液 Servicebio G1206

EDTA(PH9.0)抗原修復(fù)液 Servicebio G1203

檸檬酸（PH6.0）抗原修復(fù)液 Servicebio G1202

BSA Servicebio G5001

4%多聚甲醛 Servicebio G1101

PBS緩沖液 Servicebio G0002

熒光一抗：

熒光二抗：

DAPI Servicebio G1012

抗熒光淬滅封片劑 Servicebio G1401

二、冰凍切片免疫熒光實驗步驟

1、冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復(fù)溫，晾干水分,多聚甲醛固定10min，待多聚甲醛完全干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。低火10min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。（修復(fù)液和修復(fù)強度根據(jù)組織來確定）

3、畫圈血清封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），甩干PBS，滴加BSA，封閉30min。

4、加一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

5、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

6、DAPI復(fù)染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

7、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）

三、冰凍切片免疫熒光實驗結(jié)果判讀

DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，陽性表達為相應(yīng)熒光素標記的紅光或者綠光

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